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Labornachweis von PRRSV-Antigenen
Eine eindeutige Diagnose von PRRS bei kranken Schweinen kann durch den Nachweis mikroskopisch sichtbarer, PRRSV-typischer Läsionen in Verbindung mit dem Nachweis von Virusantigenen im geschädigten Gewebe erfolgen. Mithilfe des Fluoreszenz-Antikörper-Tests (FA) von Gefrierschnitten des Gewebes und der Immunohistochemie (IHC) können PRRSV-Antigene im Gewebe nachgewiesen werden (Abb. 1). Diese Tests werden mit PRRSV-spezifischen, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern kombiniert. Der direkte FA-Test von Gefrierschnitten des Gewebes ist kostengünstig und geht schnell. Der Test ist zwar spezifisch, aber nicht immer sehr sensitiv. Insbesondere die Qualität des Gewebes (z. B. Autolyse) hat Einfluss auf die Testergebnisse. Im Gegensatz dazu dient IHC dem Nachweis von Virusantigenen in Formalin-fixiertem Gewebe. Die IHC ist sensitiver als der direkte FA-Test, benötigt aber mehr Zeit und ist teurer als der FA-Test.
Abbildung 1: In Gewebe nachgewiesenes PRRSV-Antigen
Für den direkten FA-Test sollte frisches oder gefrorenes Gewebe verwendet werden. Für die IHC sollte das Gewebe in 10% neutralgepuffertem Formalin fixiert sein. Eine lange Gewebefixierung in Formalin beeinträchtigt allerdings eine effektive Antigenerkennung durch IHC. Wenn eine Verzögerung bei der Durchführung des Tests zu erwarten ist, wird empfohlen, das Gewebe nach der Fixierung in Formalin in Alkohol zu legen. Das Gewebe von Herz, Niere, Lunge, Lymphknoten, Milz, Thymus und Mandeln wird für diese Tests bevorzugt. PRRSV-Antigene können ebenso in der Nebenniere, dem Darm, der Leber und gelegentlich im Gehirn nachgewiesen werden. Bei der Durchführung eines FA- und IHC-Tests können monoklonale Antikörper benutzt werden, die sich spezifisch gegen Antigene richten, die unter den US-amerikanischen und europäischen Isolaten hoch konserviert sind. Zur Bewertung der antigenischen Unterschiede zwischen Stämmen könnte man monoklonale Antikörper gegen weniger konservierte Epitope einsetzen. Wenn die PRRS-Diagnose durch den FA-Test oder IHC zu machen ist, wäre es aufgrund der hohen Spezifität der monoklonalen Antikörper und der starken antigenen Variabilität des PRRS-Virus ratsamer, mehr als einen monoklonalen Antikörper im Test zu benutzen, um eine Fehldiagnose zu vermeiden.
Nachweis von genomischem PRRSV-Material
Zum Nachweis von PRRSV-RNA (also Nukleinsäure) in klinischen Proben wurden Tests auf Grundlage der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Da das Virus nicht in Zellkultur isoliert werden muss, um virale RNA nachzuweisen, kann der PCR-Test viel schnellere Testergebnisse liefern als die Virusisolierung. Grundsätzlich gelten PCR-basierte Tests als hochempfindlich und hochspezifisch.
Abbildung 2: Nachweis von genomischem PRRSV-Material in klinischen Proben durch automatisierte PCR-basierte Fluorogentests
Um genomisches PRRSV-Material in klinischen Proben nachzuweisen, wurden verschiedene Arten von PCR-basierten Tests entwickelt, die spezifische Primer benutzen, die komplementär zu den Sequenzen verschiedener Genomfragmente sind. Mit einem PCR-basierten Test zum Nachweis von PRRSV muss die virale RNA aus den klinischen Proben extrahiert und mithilfe einer reversen Transkriptase (RT) in komplementäre DNA (cDNA) verwandelt werden. Folglich ist die cDNA durch das PCR-Verfahren, bei dem ein Taq-Polymeraseenzym und virusspezifische Primer verwendet werden, exponentiell amplifiziert. Mit der genauen Übereinstimmung der Primer und der anschließenden exponentiellen Amplifikation soll ein hochempfindlicher und hochspezifischer Test gewährleistet werden. In jüngerer Zeit wurden automatisierte PCR-basierte Fluorogentests (also RT-qPCR) zum Nachweis von genomischem PRRSV-Material in klinischen Proben entwickelt. Diese PCRs verwenden eine einstufige Amplifikation in einem einzigen Röhrchen, in dem fluoreszierende Marker an das PCR-Produkt binden, sobald es entsteht (also „Real-time” PCR). Man geht davon aus, dass durch fluorogene PCRs die Zuverlässigkeit und Konsistenz konventioneller RT-PCRs zum PRRSV-Nachweis verbessert wird (Abb. 3).
Abbildung 3: Fluorogene PCRs zum PRRSV-Nachweis
PCR-basierte Tests wurden bei zahlreichen klinischen Proben wie oralen Flüssigkeiten und Umweltproben zum Nachweis von PRRSV-RNA eingesetzt. PCR ist besonders hilfreich beim Nachweis viraler RNA in Proben wie Sperma oder Kot, die entweder einen zytotoxischen Effekt auf die Zellkultur haben oder nicht durch andere Methoden beurteilt werden können. Das Verfahren hat sich außerdem auch zum Nachweis von PRRSV-RNA bei fetalem Gewebe und thorakalen Flüssigkeiten als nützlich erwiesen, also bei Proben, bei denen PRRSV leicht durch den Prozess der Autolyse inaktiviert werden kann. PCR-Tests werden mittlerweise häufiger sowohl zur Diagnose von PRRS als auch zur Unterstützung bei der Überwachung und Kontrolle des Betriebs (d. h. beim Screening von Ersatztieren, Nachweis von Dauerträgern und bei Test- und Bekämpfungsprogrammen) eingesetzt oder zur Biosicherheit (also bei der Umweltprüfung, Lkw-Kontrolle, Spermauntersuchung) genutzt.
PCR ist im Vergleich zu anderen Diagnoseverfahren teuer. Es darf auch nicht vergessen werden, dass ein positives PCR-Ergebnis das Vorhandensein viraler RNA zeigt und nicht notwendigerweise auf das Vorkommen von infektiösem PRRSV hindeutet. Darüber hinaus kann die Durchführung von PCR-Tests unter den einzelnen Labors je nach Zustand der Proben, der Probenaufbereitung, den Extraktionsverfahren, benutzten Primern, den Bedingungen der Wärmezyklen und den Kenntnissen und Erfahrungen des Laboranten, der den Test durchführt, variieren. Deshalb, ist es für die Laboratorien, die eine PCR durchführen, wichtig, ihre Tests zu bewerten. Diese Bewertung sollte die Einschätzung der Sensitivität, der Spezifität, Vergleiche mit den Standardtests, die Ergebnisse von Eignungsprüfungen sowie experimentelle Studien oder Feldstudien zur Leistung des Tests beinhalten.
