PCR-Test als Diagnoseinstrument (1/2): Die Grundlagen

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist heute eines der am häufigsten verwendeten Diagnoseinstrumente in der Schweinemedizin. Sie wird nicht nur zu diagnostischen Zwecken eingesetzt, sondern auch als Mittel zur Verbesserung der Biosicherheit durch Kontrolle und Krankheitsmonitoring. Daher ist es wichtig, bei der Interpretation der Ergebnisse die Vor- und Nachteile dieses Verfahrens zu kennen. Es ist ebenfalls wichtig zu wissen, dass es, auch wenn dieselbe Technologie für verschiedene Krankheitserreger verwendet wird, Unterschiede bei der Interpretation dieser Ergebnisse geben sollte.

Informationen zum Test

Der PCR-Test ist für den Nachweis von genetischem Material (DNA oder RNA) von Bakterien oder Viren bestimmt. Der Prozess beginnt mit der Extraktion der DNA oder RNA aus der Probe, die dann thermischen Amplifikationszyklen unterzogen wird. Handelt es sich bei dem entnommenen Material um RNA, besteht der erste Schritt darin, die RNA in DNA umzuwandeln (die technisch als cDNA bezeichnet wird). Die thermischen Zyklen sollen einen dreistufigen Prozess aus 1) Denaturierung, 2) Primerhybridisierung und 3) Elongation erzeugen, der zur Vervielfältigung des in der Probe vorhandenen DNA-Materials führt. Nach jedem Zyklus (1 Ct) ist also bei einer Effizienz von 100 % die doppelte Menge an DNA vorhanden. Ziel ist es dann, den Amplifikationsprozess so lange bzw. je nach dem Design des verwendeten Tests bis zu 30-40 Zyklen fortzusetzen, bis genügend DNA nachgewiesen wurde, um die Probe positiv zu testen, bzw. je nach dem Design des verwendeten Tests bis zu 30-40 Zyklen durchzuführen.

Der Extraktionsprozess ist ein kritischer Schritt des PCR-Tests, da er sich auf die Quantität und Qualität des genetischen Materials in der getesteten Probe auswirkt. Es ist wichtig, das richtige Extraktionsverfahren für die zu untersuchende Probenart (Serum, Mundflüssigkeit, Gewebe usw.) zu verwenden. Schritt 2 der Primerhybridisierung (Primer Annealing) erfordert den Einsatz von Primern, d. h. kurzen DNA-Sequenzstücken, die speziell dafür entwickelt wurden, sich nur an die spezifische genetische Sequenz des betreffenden Erregers zu heften und diese zu replizieren. Bei Erregern, die sich genetisch ständig weiterentwickeln (wie z. B. das PRRS-Virus), müssen diese Primer regelmäßig aktualisiert werden, um sicherzustellen, dass auch neue Stämme erkannt werden.

Der Cutoff-Wert für den Testzyklus (in der Regel etwa 30-40) wird in Anerkennung der Tatsache festgelegt, dass der Test bei fortgesetzter Amplifikation irgendwann einfach aufgrund spontaner Primerhybridisierung und Elongation positiv ausfallen wird. Dies bedeutet, dass man schwach positive Ergebnisse mit hohen Ct-Werten nahe dem Cutoff bei der Interpretation der Ergebnisse am Ende eines Ausbruchs speziell berücksichtigen sollte.

In der Schweinemedizin gibt es zwei verschiedene PCR-Tests: die traditionelle PCR auf Gelbasis und die modernere Echtzeit-PCR. Beide Tests funktionieren gleich und beruhen auf der Amplifikation der DNA oder RNA. Der Unterschied besteht darin, dass der Gel-basierte Test nur einmal am Ende des Tests „abgelesen“ wird, während bei der Echtzeit-PCR die Testergebnisse nach jedem Zyklus „abgelesen“ werden. Der Vorteil der Echtzeit-PCR ist, dass sie quantitative/semiquantitative Ergebnisse liefert.

Pooling von Proben für die Testung

PCR-Tests sind aufgrund der Vervielfältigung des genetischen Materials in der Probe in der Lage, kleine Mengen genetischen Materials in den Proben nachzuweisen (analytische Sensitivität). Dies bietet die Möglichkeit, mehrere Proben mit einem einzigen Test zu untersuchen (Pooling). Es ist wichtig, daran zu denken, dass das Pooling per Definition eine Verdünnung der auszuwertenden Probe bedeutet. Dies sollte kein Problem darstellen, wenn die erwartete Konzentration eines bestimmten Erregers hoch ist (insbesondere bei einem frühen Ausbruch der Krankheit). Das Pooling kann allerdings dann ein Problem darstellen, wenn die Erregerkonzentration in einer positiven Probe niedrig ist, z. B. am Ende eines Krankheitsausbruchs oder bei einer Probenart, bei der bereits eine Verdünnung zu erwarten ist (orale Flüssigkeiten).