PCR-Test als Diagnoseinstrument (2/2): Einsatzbereiche und Interpretation der Ergebnisse

Einige Einsatzbereiche von PCR-Tests:

• Nachweis vorhandener DNA/RNA eines bestimmten Krankheitserregers – häufigste Anwendung
• Serotypisierung eines Erregers durch gezielte Suche nach spezifischen Genen (DNA/RNA), von denen bekannt ist, dass sie sich je nach Serotyp unterscheiden (z. B. Kapselbiosynthesegene für Actinobacillus pleuropneumoniae)
• Nachweis vorhandener Virulenzgene (z. B. Genotypisierung von E. coli)

Es ist wichtig, daran zu denken, dass PCR-Tests nur das Vorhandensein des ins Visier genommenen genetischen Materials auf der Grundlage von Primern nachweisen und nicht anzeigen, ob der Organismus infektiös ist oder nicht. Beim Test auf Gene wird nur das Vorhandensein des Gens nachgewiesen, nicht aber, ob der Organismus den nachgewiesenen Virulenzfaktor exprimiert.

In den letzten Jahren haben Labors die Multiplex-PCR entwickelt, um die Proben auf mehrere Krankheitserreger bzw. mehrere Stämme oder Gene desselben Erregers gleichzeitig zu testen. Bei diesen Multiplex-PCRs handelt es sich um mehrere PCRs, die gleichzeitig durchgeführt werden. Die Kosten dafür sind höher als die einer einzelnen PCR, aber deutlich geringer als die getrennt laufender PCRs, da das Labor erhebliche Einsparungen beim Geräteeinsatz, beim Laborpersonal und bei den Reagenzien erzielt. Das Labor verwendet verschiedene Marker, um zu erkennen, welche positiven Ergebnisse zu welchen Primern gehören. Oft sind diese Multiplex-PCRs sinnvoll, wie z. B. bei der Genotypisierung von E. coli, bei der gleichzeitig etwa 14 Gene am selben bakteriellen Isolat untersucht werden können. Ein weiteres Beispiel ist der gleichzeitige Test auf PRRS Typ 1 und Typ 2. Ein weiteres gängiges Testschema ist die gleichzeitige Untersuchung auf Porzine Epidemische Diarrhö und das porzine Delta-Coronavirus. Es ist zu beachten, dass die Durchführung dieser Tests nicht immer einfach ist, da das Labor sicherstellen muss, dass es keine Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen PCR-Tests gibt. Das heißt, dass die Zyklustemperaturen und die verschiedenen verwendeten Primer sich nicht gegenseitig hemmen oder kreuzreagieren dürfen. Jeder dieser Multiplex-PCRs muss vor dem Einsatz validiert werden, und es muss eine starke Optimierung des Tests erfolgen.

Überlegungen zur Interpretation der Ergebnisse:

Eine der Herausforderungen bei PCR-Tests besteht darin, dass oft jedes Labor ein anderes Protokoll für seine Probentests hat, das Unterschiede im DNA/RNA-Extraktionsverfahren, Unterschiede in den Zyklusprotokollen sowie Unterschiede bei den verwendeten Primern beinhalten kann. Aus diesem Grund kann es schwierig werden, die von verschiedenen Labors erzielten Ergebnisse genau zu vergleichen.

Negatives Ergebnis

• Probe/Betrieb wirklich negativ bezüglich des Erregers
• Vergewissern Sie sich, dass die richtige Probe für den betreffenden Erreger eingereicht wurde. Beachten Sie einige klassische Beispiele:
  • Das Influenzavirus wird nicht systemisch übertragen und ist daher in Blutproben nicht nachweisbar.
  • Der Test auf Mycoplasma hyopneumoniae in der Mundhöhle liefert nur selten ein positives Ergebnis, da der Erreger in der Regel an den Flimmerhärchen im unteren Teil des Atemtrakts haftet.
  • Wenn nur 1 Fötus aus einem PRRS-Abort eingereicht wird, besteht eine nur 50%ige Chance auf ein positives Ergebnis. Deshalb sollte man mindestens 4 Föten einreichen, um die Chance auf eine positive Probe zu erhöhen.
• Die Probe wurde zu spät entnommen und der Erreger ist nicht mehr vorhanden.
  • Grippeviren sind nur in den ersten 3-4 Tagen in den Nasensekreten vorhanden
• Nichtübereinstimmung des Primers
  • Neuer PRRSV-Stamm
• Niedrige Prävalenz im Betrieb und die beprobten Tiere waren nicht infiziert
  • Die Zahl der beprobten Tiere muss deutlich erhöht werden.
• Verdünnung einer schwach positiven Probe aufgrund von Pooling
  • Pooling oraler Flüssigkeiten, bei denen es sich traditionell um bereits verdünnte Proben handelt (Testung mehrerer Schweine und bereits erwartete hohe Ct-Werte bei positiven Proben)

Positive Probe

• Probe/Bestand tatsächlich positiv auf Erreger
• Es kann nicht unterschieden werden, ob die Probe infektiös oder nicht infektiös ist
• Je nach vorhandenem Erreger bestätigt der Nachweis von DNA/RNA nicht immer die Krankheit
  • PCR-positives Lungengewebe bezüglich Mycoplasma hyopneumoniae bestätigt das Vorhandensein des Erregers im Gewebe, nicht aber seine klinische Bedeutung oder den Schweregrad der Krankheit. In den meisten Betrieben (mit Ausnahme Mycoplasma-negativer Betriebe) muss der Prozentsatz der Lungenschädigung visuell bestätigt werden (Auswertung auf makroskopischer Ebene), um die klinische Bedeutung der Befunde zu bestimmen.
  • Ein PCR-positiver Serumtest auf das Porcine Circovirus Typ 2 (PCV2) bestätigt das Vorhandensein von PCV2, bestätigt jedoch nicht, ob das Kümmern oder die Lungenentzündung auf PCV2 zurückzuführen sind oder ob ein Impfversagen vorliegt. Zum Nachweis einer mit PCV2 assoziierten Erkrankung ist eine immunhistopathologische Untersuchung von Lungen- und/oder Lymphgewebe erforderlich.
  • Der Test ist möglicherweise nicht in der Lage, Impfstoffviren/-bakterien aus modifizierten Lebendimpfstoffen von Wildtyp-Infektionen zu unterscheiden.
    • Entscheidend ist, den zeitlichen Verlauf und die Art des verwendeten Impfstoffs zu kennen
    • Informationen zur Sequenzierung können erforderlich sein
• Kreuzkontamination bei unsachgemäßer Handhabung der Proben
  • Dies gilt insbesondere für das Pooling von Proben. Das Pooling sollte unter einem Laborabzug durchgeführt werden.
  • Vom Boden entnommene Fäkalproben können mit Resten des Erregers aus der Umwelt kreuzkontaminiert sein
• Niedrige Ct-Werte werden mit einer hohen viralen/bakteriellen Konzentration in der Probe in Verbindung gebracht und können oft mit einer höheren Wahrscheinlichkeit für eine klinische Erkrankung korreliert werden
  • Niedrige Ct-Werte von Lawsonia intracellularis in den Fäkalien werden eher mit Darmläsionen in Verbindung gebracht.
    • Ct < 20 → Proliferative Enteropathie des Schweines
    • Ct > 30 → Keine intestinalen Läsionen festgestellt

Genotypisierung

• Die PCR-Genotypisierung wird immer häufiger eingesetzt, insbesondere bei E. coli. Sie liefert epidemiologische Informationen über Veränderungen bei Isolaten, die sich auf den Betrieb auswirken (z. B. Influenza H1N1 gegenüber H3N2).
• Häufig werden die Ergebnisse der Genotypisierung bei der Auswahl des zu verwendenden Impfstoffs verwendet, z. B. bei E. coli (Bestätigung der Pili).
• Man darf nicht vergessen, dass die Ergebnisse nur ein einziges Isolat repräsentieren und dass Schweine oft mit mehreren Isolaten gleichzeitig infiziert sind.
• Der Nachweis bestätigt nur das Vorhandensein der Virulenzgene, nicht aber deren Expression. Oft reicht es aus, zu wissen, dass das genetische Potenzial zur Expression des Gens besteht.
• In dem Maße, in dem die Kosten und die Einfachheit der Gensequenzierung weiter sinken, wird die Verwendung oder der Bedarf an PCR-Genotypisierung abnehmen.